（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：

Ⅰ.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）

肝细胞肝癌(hepatic cellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发病56.4万例，其中42. 5%发生在中国，且有上升趋势[1]。自20世纪90年代起肝癌在我国已为第二位癌症杀手，其死亡率为20.4/10万，占全部恶性肿瘤的18.8%[2]。国内外研究结果表明，HBV 持续感染是肝癌最重要的病因之一[3]。全世界乙型肝炎病毒慢性感染者估计有3.5亿- 4亿，其中约25%最终发展为肝硬化和肝癌。WHO肝癌预防会议指出：HBV 感染与肝癌相关性高达80%[4]。在我国肝癌90%以上有HBV感染的血清学证据，乙型肝炎患者发生肝癌的机率比正常人群高5-30倍[5]。由此可见HBV 感染与肝癌的因果关系密切。甘肃省属于乙肝高发地区，乙肝发病率大大超过全国10％的平均水平，近年发病率在133/10万左右，是全国平均发病率的3倍，2001年居全省各类传染病发病首位。目前全省至少有260万人为乙肝病毒携带者，每年至少有3万人感染乙肝病毒。肝硬化和肝癌的发病率也远高于全国平均水平(甘肃省卫生厅疾控处, 2006)。因此探讨中国甘肃地区乙肝相关肝癌的发病机制、遗传易感因素具有重要的医学价值。

Joo HY 等研究表明HBV 诱导肝癌的机制主要涉及HBV 的DNA 与肝细胞基因组的整合以及乙肝病毒X蛋白（HBx）的致癌作用[6]。HBx 是乙肝病毒X 基因的表达产物, 具有反式激活功能, 可通过从转录水平激活细胞生长调节基因、调节细胞调亡、抑制受损DNA 的修复等机制导致肝癌的发生, HBx 的这些作用通过其与细胞内其他蛋白质的相互作用以及激活细胞内的信号传导通路来实现[7]。近年来，环氧合酶（cyclooxygenase-2，COX-2）作为一个非常重要的肿瘤相关基因，得到了广泛的重视。大量研究发现COX-2 在人类多种恶性肿瘤组织中都有较高水平表达，肝癌中也发现COX-2 异常表达[9]。通过抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤组织血管生成以及提高肿瘤细胞的扩散能力等机制,参与肝癌等多种肿瘤的发生与发展[10] [11]。Cheng 等研究发现转染了HBx 的Hep3B 肝癌细胞株中COX-2 表达和PGE2 合成均增强，提示HBx 可能通过促COX-2 作用机制导致肝癌的发生、发展[8]。

J. Ke 和Kyung-Soo 等研究证实，在COX-2 基因5′端包含一个保守的启动子元件TATA 盒和多个顺势调控元件，包括白细胞介素6 核因子(NF-IL-6)、激活蛋白-2 (AP-2)、Sp1 ( specific protein1 )、核转录因子-κB(NF-κB)、CRE ( cAMP 反应元件)等[12] [13]。这些区域调控元件的突变或缺失能减少COX-2 的表达，相反激活这些调控元件能够增加COX-2 的表达。COX-2 表达的调控主要在转录水平上，即细胞受到刺激后经过一系列信号转导并作用于5′ 端转录，诱导COX-2 表达。这些刺激因素存在于细胞内外，主要有某些细胞因子、生长因子、炎性介质、致癌剂（如TPA：12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13）及一些癌基因产物等。它们主要是通过蛋白激酶C(PKC) 和RAS 介导的途径来调控COX-2 的转录[14] [15]。研究发现慢性乙型肝炎病毒可活化NF-κB，在Hep3B 细胞中, NF-κB 活化后,上调了COX-2 的活化和诱导[16]。



COX-2 被认为是一种肿瘤抗凋亡分子，主要通过其催化生成的前列腺素E2(PGE2) 起作用，PGE2 与肿瘤细胞上的前列腺素受体（EP1-4）结合，通过G 蛋白偶联途径即EP/cAMP 途径来激活细胞内的各种激酶，促进细胞增殖[17]。研究发现COX-2 特异性抑制剂NS-398 诱导HepG2 细胞凋亡时, bcl-2 蛋白表达水平呈剂量依赖性下降，而Caspase3 蛋白表达增加。因此推测COX-2 可能通过调节bcl-2 蛋白的表达抑制Caspas3，促进肝癌HepG2 细胞增殖[18]。bcl-2 家族是最重要的凋亡调节因子之一,其中bcl-2 是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因[19]。bcl-2 在线粒体膜上形成蛋白孔道使细胞线粒体跨膜电位下降，细胞色素C 释放，激活Caspase 蛋白酶级联反应[20]。凋亡蛋白酶 (Caspase) 是一组对底物天冬氨酸部分有特异水解作用的富含半胱氨酸的蛋白酶，而Caspases 家族成员中研究最多、功能相对较明确的为Caspase3，在细胞内以无活性的前体(酶原)形式存在, 被激活后在细胞凋亡中发挥关键作用。Caspase3 为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶,被称为凋亡的“执行者”。

遗传易感性在乙肝相关性疾病(乙肝、乙肝后肝硬化、乙肝相关性肝癌)的发生发展中的作用受到研究者的广泛关注。人群中存在易感个体是由于一些与乙肝相关性疾病发生相关的基因存在多态性，最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。综合目前世界上相关报道：COX-2在恶性肿瘤中的表达率，在不同地域以及不同种族、人群中存在差异[21]。研究发现COX-2基因多态性会改变酶的表达水平或其的生化功能，对前列腺素的生物合成产生重要影响，从而使肿瘤的易感性升高或下降。COX-2基因有些多态位点可以改变个体对炎症性疾病和恶性肿瘤的发病风险 [22-27]。目前已发现COX-2基因启动子区域的-765G/C、-899G/C 、-1195G/A、-1290A/G基因突变（SNP）与大肠癌[22]、前列腺癌[23]、胆管癌[24]、胃癌[25][26]、食管癌[27]等多种恶性肿瘤的发病风险相关。我们课题组前期的研究发现：COX-2基因启动子区-765G/C多态性与甘肃人群胃癌、乙肝相关性肝癌易感性相关[28-30]。研究表明COX-2 -765 bp正好均位于 COX-2 基因的启动子区的SP-1结合位点[31] ， SP-1是一个O-糖基化的正性转录调节因子, 通过识别富含G的10个核苷酸长度的同源序列5'-GGGGCGGGGC-3'， (如GC盒)而起作用[32]。  因此，在此区域的碱基改变，如G/C多态性，可能会影响SP-1与启动子区域相应反应元件的结合，进而影响COX-2转录水平。研究证实与COX-2- 765 GG型相比，CC型携带者启动子活性降低 -30%[33]。这种改变可能会影响COX-2 的转录和表达，进而改变了机体对肿瘤的易感性[23]。

为了进一步明确COX-2基因启动子区-765G/C多态性如何影响乙肝相关性肝癌发生的易感性，本课题拟对这两个多态位点进行功能研究，以COX-2 凋亡信号转导通路为线索，试图阐明-765G/C多态性对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。并为进一步针对基因多态性位点进行有效的基因治疗奠定理论基础。   





参　考　文　献

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Ⅱ.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究内容

1.采用基因测序方法检测乙肝相关肝癌患者的组织标本中COX-2基因 -765G/C单核苷酸多态性，分型归纳组织标本。

2. 采用RT-PCR检测 COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌组织COX-2 的mRNA 转录水平差异。  检测 COX-2 -765 G/G不同 基因型患者肝癌组织中 COX-2、PGE2 及下游分子bcl-2、caspase3 的蛋白表达水平，揭示COX-2   -765G/C不同基因型对肝癌细胞增殖、凋亡的影响作用。

3. 对COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型肝癌患者的临床病理特征（病灶数目、大小、包膜完整性、门静脉癌栓、BCLC分期）进行分析，明确-765 G/C对肝癌临床病理进展的影响。

4.分离原代培养COX-2 -765不同基因型肝癌细胞，观察COX-2 -765 G/G各基因型细胞增殖、凋亡水平差异；检测COX-2 -765 G/G各 基因型细胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的蛋白表达水平差异，体外验证 COX-2   -765G/C不同基因型对肝癌细胞增殖、凋亡的影响作用。



研究目标

1. 明确COX-2 基因启动子区-765G/C多态性对COX-2 下游涉及增殖、凋亡相关分子的表达水平的影响，以及乙肝相关肝癌临床病理进展的关系；

2.揭示COX-2 基因启动子区-765G/C多态性的生物遗传学意义，为针对该多态位点设计相应的基因干预治疗奠定基础。

拟解决的关键问题

1．分离并原代培养COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌组织中的肝癌细胞进行干预实验；

2. 阐明 COX-2  -765G/C多态性对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。







Ⅲ.拟采取的研究方案及可行性分析。

研究方法

1. 研究对象：选择甘肃省常住人口（超过15年），确诊为原发性肝癌 患者若干例。(既往乙肝病史，血清学检查阳性，临床检验、影像学或病理学均确诊)。同时采集流行病学和临床病理资料，每位对象被告知研究细则，并签署知情同意书，调查表包括以下信息： a.人口学特征，如年龄、性别等；b.其他肝胆疾病病史及使用药物、毒物接触情况；c.吸烟史、饮酒史和生活饮食习惯；d.肝癌家族史：研究对象至少有一个直系亲属（包括父母、兄弟或姐妹）是肝癌患者。临床病理资料包括：病灶数目、大小、包膜完整性、门静脉癌栓、BCLC分期等。

2. 采集标本：实施肝癌手术的患者留取肝癌组织标本，分别进行-20摄氏度冻存、-196摄氏度液氮冻存和福尔马林固定、石蜡包埋制片。

3.  单核苷酸多态性分析：对-20摄氏度冻存肝癌组织标本，提取DNA，采用基因测序法对COX-2 基因的启动子区-765G/C多态进行检测，根据检测结果，将获取组织标本按照COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型分组，保证各组10例以上。

4.  采用荧光定量RT-PCR法检测COX-2 的mRNA 在-765 G/G 各基因型癌组织中表达水平。

5.  分别采用免疫组化和western blot法检测肝癌组织标本中COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的表达水平。

6.  细胞实验：从COX-2  -765 GG、GC、CC 各基因型肝癌组织标本中分离、并原代培养肝癌细胞。

7.  RT-PCR法检测-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌细胞中COX-2 的mRNA的表达差异。

8. 分别采用细胞免疫化学和western blot 法检测-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌细胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的表达水平。

9.  采用CCK-8 检测-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌细胞增殖水平差异；采用Anexin-V和PI 双染法检测各组肝癌细胞凋亡差异。

10. 统计分析：运用SPSS17.0软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

技术路线及实验流程见下表：























                                     













                                 



                                 

















可行性分析：

1． 目前SNP 的研究已经涉及到代谢酶基因、DNA修复基因、致癌物基因、癌基因、抑癌基因等方面。基因多态性与肝癌的发病机制倍受国内外学者的关注。

2． 甘肃肝癌发病率较高，可以得到大量的实验标本，也可得到对照组的对照标本，开展此项研究有很大的便利性。研究手段及荧光定量PCR、West blotting等实验方法已成为常规的分子生物学研究方法。

3． 我院与兰州大学第一医院建立密切合作关系，兰州大学第一医院设有甘肃省肝胆胰研究所、甘肃省分子生物学研究所、兰州大学临床医学院肿瘤研究所等，项目实验所需设备齐全，专业的科研人员可以保证实验的严谨性和可靠性。

4． 本单位从事基因研究多年，拥有全套设备；该研究团队在肝癌发病研究中做了大量的工作、具有很强的科研能力；承担了多项国家级、省部级科研项目，具有良好的科研素质，作风严谨，能够吃苦耐劳，而且高、中、初级人员结构合理，这是完成该项目的重要人力保障。



Ⅳ. 本项目的特色与创新之处。

1. 明确COX-2 基因启动子区-765G/C多态性对COX-2 及下游涉及增殖、凋亡相关分子的表达水平的影响，以及乙肝相关肝癌临床病理进展的关系；

2. 分离并原代培养COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌组织中的肝癌细胞进行干预实验；



Ⅴ.年度研究计划及预期研究结果。

年度研究计划

1．2014年09月——2015年3月

完成乙肝后肝癌标本的采集及健康志愿者标本的采集和乙肝后肝癌患者流行病学的临床资料采集工作；对各组织标本分类保存；进行预实验。

2．2015年04月——2017年4月

采用RT-PCR检测 COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌组织COX-2 的mRNA 转录水平差异。  检测 COX-2 -765 G/G不同 基因型患者肝癌组织中 COX-2、PGE2 及下游分子bcl-2、caspase3 的蛋白表达水平，揭示COX-2   -765G/C不同基因型对肝癌细胞增殖、凋亡的影响作用。分离原代培养COX-2 -765不同基因型肝癌细胞，观察COX-2 -765 G/G各基因型细胞增殖、凋亡水平差异；检测COX-2 -765 G/G各 基因型细胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的蛋白表达水平差异，体外验证 COX-2   -765G/C不同基因型对肝癌细胞增殖、凋亡的影响作用。

3．2017年5月——2017年12月

总结资料和实验数据，进行统计学分析，撰写论文，课题结题。



预期研究成果

1. 明确COX-2 基因启动子区-765G/C多态性对COX-2 下游涉及增殖、凋亡相关分子的表达水平的影响，以及乙肝相关肝癌临床病理进展的关系，揭示COX-2 基因启动子区-765G/C多态性的生物遗传学意义。

2. 发表文章：SCI论文2-3篇，国内核心期刊文章2-3篇。



(二）研究基础与工作条件

1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

本课题组于2000年至2008年进行了大量消化道肿瘤的研究。承担了中科院、中组部“西部之光”项目——甘肃省河西地区胃癌高发相关因素及防治的研究。研究了甘肃省河西地区胃癌的流行病学状况、发病特点，发病的危险因素以及环境、生物、化学因素对胃癌的影响。自2006年课题申请人首次进行了COX-2基因启动子区基因多态性与乙肝相关性肝癌发病风险关系的研究，发现COX-2 -765G/C、-899 G/C多态性与乙肝相关肝癌发病相关，发表SCI论文2篇。

同时本项目合作者就病毒性肝炎流行病调查，发病机制及诊断治疗方面做了大量研究工作，课题细胞因子TNF-α和IL-10-1082基因多态性与甘肃地区乙型、丙型肝炎病毒感染的相关性研究已经结题，达国内先进水平，获得甘肃省科技进步二等奖。通过前期的研究工作，我们熟练掌握了基因多态性的分子生物学研究方法，与省内多家医院取得密切联系，建立了兰州大学肿瘤防治中心分所9个（地级医院6个、县级医院3个），可获取丰富的病例及标本资料。

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